一、如何防止提取过程中RNA的降解

通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。0T3z(F&_,D6c%^"h6YA6_RNA提取的一般步骤-O:Y+x$p#s8U4M9S所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。(O(g;^+K)f+i&]%P实验步骤：*l&d6s5e(q1F(g2|j,^0s破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。6D8}.Q;Y,g*X1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。"s%f,`0[1d*m!]0e2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。&X.P)i)Y;L#u/[3、沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或异丙醇。2@0d&z7?+i,g1@4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。3@%V"o9v+I1J2o9k"z5、融解RNA一般使用TE。;L5f.n6}(S1t%Z&J6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。&P3[7m*^$U$_"?:F"xu*N(?(I氯化锂法提取总RNA："u;}'I!r'^'^&l本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。#~*S:}9`*r4Z3P试验试剂："d$r6Q+_.I8Q1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L，过滤灭菌】7_8w1t"o9a'q!i4Z2、悬浮液【10mM?Tris-HCL(pH7.6),1mM?EDTA(pH8,0),0.5%SDS】!m8Q4R,]&y:b#`7d试验步骤：7[6?$`*};o7_Z'{1、对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。&Y)b:E,Q"l/^Q:\$s2、匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟。x-C6D-N/N0K!t2a3、取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2。)y-x)S0K9y6j,e4、沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。3d2v'i1~(~*D5、取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。L4a'Q4u"l:a*K%Z$?(e6、70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。3};r0[/Q'G9q7、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。0f.X%R(H%B7g!y7j5u$C'|)[%~!J3D:Q蛋白酶－热酚法6|"^0b*[)P3S*c4b4H4l本方法适合于病毒RNA的提取*I(i+b#r!K试验试剂：$?4[7H9`)J1、蛋白酶K（终浓度50ug/ml）,J5pl6V/t7[/I2、2×缓冲液：1%SDS?20mMTris-HCL(pH7.6)?0.2MnaCL9h,p]y+\$Z)O试验步骤：#W3v8G1[$]5y1、提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟。-K0p/E'G0M#Q-z7n,{#d2、加入等体积65℃预热的酚溶液，轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。w!`;W(~,E:i3^3、离心，取上清，氯仿抽提一次。,|(Z0d;j2@7m+d2Q&xH4、取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心(10000g,10min)。7[/w,h2d6U$k5、70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。%A5Y;{(w%]3a*y,Oe)P6、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。植物RNA提取过程中难点的相应对策植物RNA提取过程中难点的相应对策)o5B7d/Q3_酚类化合物的干扰及对策：a9D*Z3K?7W许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）和树木类植物中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（browningeffect）。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA分开。9b0S!}0U6|9k/l!v"vg1~/@防止酚类化合物被氧化的方法："v;y,a4k7n/Z1、还原剂法：一般在提取缓冲液中加入(-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化，有时提取液中(-巯基乙醇的浓度可高达2％。(-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀RNA时加入(-巯基乙醇（终浓度1％）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物。&H.z.p+~&t%t5G&G1M-P/q!u2、螯合剂法：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步骤中被除去。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低〔11〕。当原花色素类物质量较大时，单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物，因而需要与其它方法结合使用。p%N0w/t7r3、Tris-硼酸法：如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以与酚类化合物依*氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合。这一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂。但如果Tris-硼酸浓度过高（＞0.2M）则会影响RNA的回收率。#p8]0^8K3a4、牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会，因此提高了RNA的产量。BSA与PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性。)~#H/y(P7Q)j4G*w1G8l5、丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA。@+?-X/V9z8T8H:B3C!W'C酚类化合物的去除：&z#h)G0H&]$I1N"f.l9N通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提时除去。Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇（50％）来沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚。他认为即使多酚被氧化，其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，无需再用NaBH4来处理。5C6Y8a1SV:`2~多糖的干扰及对策：6I-b3R4~$T&O多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成RNA产量的减少；而在沉淀RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中，通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题。7['X/e,d8x(B-p(|9C&n用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度10％～30％，可以使多糖沉淀下来，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取RNA时，在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度10％以沉淀多糖。但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA时，是在用CsCl超离心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入终浓度30％乙醇来沉淀多糖的，进一步纯化了RNA样品。!i5b5m*z9G8M4~-N/D另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质。在提取某些植物材料的RNA时，是将上述两种方法结合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA时，是在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质。Su等在去除褐藻的多糖时，单独使用乙醇或醋酸钾都无效，只有两者结合使用效果最佳。6c9|5q1b9[5l1s+nFang等认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松树RNA时，缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M，通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA将RNA与多糖分离。Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释，调节Na+离子浓度至80mM，然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖。3B1h#M'{+{0U%U,K2@,v蛋白杂质的影响及对策：$@-G5o(f1s9_2V*G2n/^蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。'T7v(F1J9@+EWilcockson利用蛋白质与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70％高氯酸钠溶液中，RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度，因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA能沉淀下来而能溶于70％高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质。3qe/\*I"A&@次级代谢产物的影响及对策：:N3|)NfK#n;p'f6h0J2A0{从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质，所以，目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等综合Hughes等的选择性沉淀法、Chirgwin的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的RNA。(Ms5O%f!H-Q*\(m"`(}由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现，即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同；含有某种干扰因素的不同植物材料，其适用的RNA提取方法可能不同；即使是同一种植物同一种组织材料，但来源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一样。所以，对于某一植物或其组织来说，其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立。#S0a#G7L3S&A随着植物分子生物学研究领域的拓宽，可以肯定地说，在作为其研究基础的植物材料RNA提取过程中还会出现新的难点，但随着不断地探索和经验的积累，科学工作者们一定会迅速地解决这些难点，为植物分子生物学的发展铺平道路。植物RNA提取中的一些特殊方法植物RNA提取中的一些特殊方法$e*[2U(E%h'[多酚类植物的RNA提取：!j!d,]2V(R!B&o苹果棉花等多酚类植物提取RNA用TRIZOL一般提不出来。这个方法是验证过有效的,提取的RNA纯度不是特别高,但是用作northern足够。6j&d2u(\6W8_&o4E1X1t实验试剂：#s7s8H!R#W1y#g提取buffer200ml：NaCl1.1688g100mMTris2.4228g10mM(tris-HCl8.0)EDTA5.8450g10mMSDS2.0000g1%NaOH调至8.0,定至200ml,加200ulDEPC融解.*j)s;t2@)t4W'F试验步骤：!Ta0I*C(w5S"E*A'W1、1.5ml离心管用液N2冷冻吼加入0.1g样品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,剧烈振荡1-2min,冰上放置5min。"F3S0V5@0s7i1T2、4度12000rpm离心15min,上清转入新管,加氯仿异戊醇抽提一次。)H'L7d#d"y8@3、取600ul异丙醇,-20度沉淀20min.&w:m2r:I4\4l#J4、12000rpm离心10min。!I.Y.\8b7A5、沉淀用70度乙醇洗。k!T.D1[0w+?)_0D5?6、8000rpm5min。"A;y#}'F(`5}6I+N!x7、沉淀晾干,溶于30ulDEPC水。;^0Q-R+`5j(n'['m9M#m/r3o2O!T6z$`1m&e.^银杏等木本裸子植物的RNA提取方法：&Ai&V!H0`?6R银杏、香机等木本裸子植物，酚类和多糖等次生物质含量较多，对RNA的分离和纯化有很大干扰，严重影响了提取RNA的质量和产量，给相关的分子生物学实验的进行带来阻碍。目前，RNA的提取方法很多，采取常规的Trizol试剂盒、SDS等方法不能提取银杏RNA，而ShujunChang等(1993)的CTAB法，提取RNA质量也较差，降解也十分严重。对其提取步骤进行改进，得到质量较高的银杏RNA样品。/s4i*Vk8S)x试验试剂：!]!M(q#E7N3t;`#i.m([1、1Mtris:12.11gTris，溶于60mL水中，用浓盐酸调至Ph8.0，定容至lOOmL.用灭菌的DEPC水溶解。`4c9{)p2\4t2、500mMEDTA:18.61gEDTA"H2O加入80mL水中，搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0，定容至100mL。;V#x*j!H4y!G4M#q3c5P3、10mol/LLiCL:42.4gLiCL,100mL水溶解即可。9i)@a'\&w+cp*g4、提取缓冲液(DEPC水处理):2%CTAB（蛋白质变性剂）.2%PVPK30（去除多酚类物质）100mMTris-HCL(Ph8.0)25mMEDTA（金属鳌合剂）2.0MNaCL（去除多糖和CTAB）配法:2gCTAB,2gPVP,10mL1mol/Ltris,5mL500mMEDTA,11.7gNaCL,定容到100mL。)o+\5E!X;O#A(M+P8H*K9n0q5、亚精胺(提取时加少量)（RNA酶抑制剂）#J9g6O/h(u'd6、4%0一疏基乙醇(提取时加)（去除多酚类物质）'De,d(J.K$z!O9f7、氯仿异戊醇(24:1)（抽提蛋白质）)U)A+]4\#Q8、10MLiCL（沉淀大分子RNA）7M+b)g4J4m5C0f-\9、SSTE（溶解RNA）1.0MNaCL0.5%SDS1mMEDTA(PH8.0)10mMTrisHCL(pH8）配法:2.9gNaCL,0.25gSDS,0.5mL1Mtris,100uL500mMEDTA,pH8.0,定容至50mL。.m5z+J3X0V&\6e7Y#R试验准备：;_5z9}"f%q6t1、研钵和玻璃器皿用锡纸包好，200℃以上向温烘烤2小时以上，或180*C高温烘烤4小时。;X7n3w,W2}9M2、塑料制品(枪头和离心管)最好用新的，并且用报纸包好，121'C高压灭菌，灭菌40min，或连续两次121'C高压灭菌，每次灭菌20min，然后用烘箱烘千。;X*f+~,v7}.a3、所有溶液配制好后，加DEPC水使DEPCuJ浓度为0.1%,37℃过夜，1211C高压灭菌40min.(其中Tris因为不能用DEPC处理，所以Tris用DEPC处理的水溶液灭菌后配制。))x&B,{%e"^&F:s0q试验步骤："Y6U+`2C*\4X2a#r【根据文献(ShujunChang,1993)CTAB法，稍作改进。】;F^+e9I#h/Q7m*A*]1、将4mL提取液加入到lOmL离心管c卜650C水域加热。$D+?4w7\3J:w,M2、用液氮冷却研钵，在研钵中加入少量的抗氧化剂PVP，取1g低温冷冻的银杏叶片，迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即加入到预热好的提取缓冲液中，用手摇功混匀。6C4i+L/Z*C5G)v3、65℃，水域1min后冷却至室温。(N2@)U:S,{9M"e8f4、加入等体积(4mL)的氯仿:异戊X17(2=L:1)，混匀，10000rpm,40C，离心10min。(H6Po1y8p#?5、小心吸取上清液，加入等体积(4mL)的仿:异戊醇(24:1),混匀，10000rpm,40C,离心10min。.{#k/z5r:x:v1x6、吸取上清液，加1/4体积的IOMLiCL,混合，4℃沉淀过夜，然后10000rpm离心20min。7xP4o6z1D![8}7、用枪吸干，用500uLSSTE溶解沉淀，转到1.5mL离心管.加等体积氯仿:异戊醇混匀，10000rpm,40C，离心10min。,H2b7C1d*[6r4c8、离心吸取取上清液，加两倍体积的无水乙醉，-70℃沉淀至少30min，或一200C下沉淀2h。"W*c'Y1P-t5K)^,`9、12000rpm,40C,离心20min，去上请用70%的乙醇洗两次，吹干沉淀。1x,S*X0V"y6F/l10、用40uLDEPC处理的水溶解沉淀，得到RNA样品。8f2C-S4R3O9R4Te&{11、除用于电泳和紫外检测外，其余RNA-70℃冰箱保存备用。Q0o7V.]9x,{1i:__!U*X1m5G9A(W%U改良Krapp提取法：1r)r#s3~|.q1v.w试验试剂：'C7Z1^)J5A&f&W(Kd1、RNA抽提掖：母液：4mol异硫氰酸胍20mmolEDTA20mmolMESpH7.0。工作液：取400ml母液加入1.7ml2-ME贮存在4℃条件下备用。/a.I$E.RS%z2、RNA重悬液：2molLiCl10mmolNaAc调整终体积为250ml，pH5.2，灭菌后贮存在4℃条件下备用。2u;J1S9V8a.j试验步骤：)O/o,L#q-D8v)U1、取新鲜植物材料0.5~1g，冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入10mlRNA抽提掖充分混匀。7nQ:B"SN9B!J$u2、4℃条件下8000rpm离心10min，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4℃条件下8000rpm离心10min。1N:K+]3R"a7`3、上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混匀后，在4℃条件下8000rpm离心10min.）。$p+y,P/^-w/E'g"k0y:[4、小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10vol3molNaAc和2vol冷无水乙醇，在-80℃条件下沉淀2小时。:t&M8O1O!C-w5a5、在4℃条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4℃条件下1小时。9b7Z#K4v(y%l8Q0a8N)I%|6、4℃条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装，置于-70℃条件下保存。

二、鸟类红点颏生病了如何治疗

感冒和鼻炎的症状、治疗 uvG' Kx

感冒症状pTeN[Yu?

有水样鼻液流出。羽毛松乱，不喜欢运动。精神沉郁，结膜充血潮红，怕光流泪，体温微升或升高，食欲下降，呼吸教急促。打喷嚏、流鼻涕、咳嗽，拉稀便找暖和互相拥挤。 h4ozwVA

鼻炎症状 G]v BI=

打喷嚏、鼻塞、流清水样鼻涕，眼内似有泪水，呼吸不畅，张口呼吸，力图将鼻腔分泌物甩出而摇头。随着病情的延续，鼻腔分泌物变为比较粘稠、混浊。治疗不及时并发支气管炎。 p C^=?!:U

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感冒的治疗%fuV
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抗生素、磺胺类、青霉素、螺旋霉素等等。加服维生素C每天2～3次每日5～6毫克／千克，连服3～6天。_.%U}U

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鼻炎的治疗'vwu^u?

1。抗生素稀释成水剂，对准鸟头部喷雾，每日2～4次。鸟喘气时对准咽、鼻喷效果最好。庆大加水20毫升；青霉素加水20～40毫升。 vc%=V^)N7U

2。滴入法：庆大滴鼻孔内［同时向咽喉滴入］1～2滴， 1SF8D`3

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如上可以看出，两种病治疗的办法和使用的药物有所不同。. 7!F-.kG

如果是鼻炎，按感冒治疗不仅要延长治疗期，还会延误病情，并发支气管炎。RNo~}#

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啄羽癖的分析和预防~_SRcM{

啄羽癖是鸟的一种异常行为，发生的原因很多，啄羽部位以翅羽、尾羽为最多。 w2SN=X~#

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啄羽原因： Wm&*

1.饲料玉米面含量偏高，蛋白质缺乏，特别是含硫氨基酸缺乏是造成禽啄羽症的重要原因。>fi_:o

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2.维生素缺乏，如B族维生素或维生素D缺乏。 cT5BBR

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3.矿物质及微量元素缺乏，如钙磷不足或比例失调缺乏等。G0A\"2U

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4.饲料中粗纤维的含量偏低。@'A0Lq+#

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5.饲养环境不适，长期闭笼不遛，诱发啄羽。 a!EW[|[Q

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6.性大，体内性激素分泌增加，不让其叫透也易诱发啄癖。 3Vbt(K

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7.长期被压、少遛，鸟叫不出或叫不透也会诱发啄羽。b0/YX@

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8.在换羽过程中皮肤有痒感，导致鸟发生自啄现象 P4zwTEk`

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9.鸟患有白痢杆菌病、大肠杆菌病、甘保罗病的早期等都表现为啄癖。 N/'8W9#6

10.鸟患有体外寄生虫病、体表创伤、出血或炎症等均可诱发啄癖。 ^?wR{q"8

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11.当鸟发生消化不良或球虫病时，不良信息周围羽毛被粪便污物粘连、结痂，引起啄羽。 kpk03V;W{pd-I

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12.光照度太强，导致鸟发生自啄羽现象。 Nf^Cq#?r 1szObhN-l

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啄羽癖的预防：=x2 75JA(@qPyM6~}

1.保持良好的饲养环境，保证放置通风良好，鸟养性闭笼很重要，但应适时遛鸟，增加运动，定时开启帷幔。平时养性闭笼保持安静，避免噪音，防止受惊。 h,4;/\#xq$ygg

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2.饲料、饮水要充足，要注意勤更换保证新鲜。 c-SM.ZCS>>wf:\ c

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3.注意饲养卫生，笼具中粪便应定时清理，定期让鸟洗浴，浴后不要闭笼，要让鸟毛吹干，可避免生虫螨。 AsvN/b V0rQtxE{F

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4.饲料供给要多样化，保证蛋白质和必需氨基酸、矿物质、微量元素以及维生素的供给。&T=BcTJ 4'=Q:o*w`

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5.啄羽癖有发生食羽现象，则大多是由于饲料中硫酸钙不足引起的，此时可在饲料中添加0.5%～1%生石膏粉末。而有些食羽也可能是由于缺乏某些矿物质引起的，可在饲料中增加矿物质或喂些沙土，注意钙、磷物质的补充。 s+zO[/'c nGe4IY\-w

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6.在饲料中定期添加啄羽灵和多种维生素、矿物质及微量元素，尤其是雏鸟阶段应补充适量的多种维生素和鱼肝油等。 jk[$kfRnO#HH[D;z

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7.注意勤遛，避免常时间闭笼。遛要让鸟充分叫透，避免长期被压。性过大要适当让其释放些。 pA"u4 bS2g4]$'po

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鸟骨折的防治措施-0JX$} VBQAkl?(}4

鸟体某部位的骨骼发生断裂的情况称为骨折。仅部分断裂者称不完全性骨折，完全断裂者则称完全性骨折。骨折部位的皮肤、粘膜的完整性同时受到破坏，断骨端露出伤口之外时，又称开放性骨折；如该部皮肤仍保持完整时，则称之为闭合性骨折。骨折可发生于身体的任何部位，但以翅和后肢的长骨最常见。 Dxa+; b r Iz8]

笼养鸟的骨折时有发生，特别多见于生鸟，在清洁、喂料、喂水等操作或捕捉不当时，常可发生翅、腿或掌部骨胳等的骨折。此外，软骨病病鸟也有时发生自发性骨折。 N_$#pIW=1dczJHV

外伤性骨折多为单侧性，其临床表现与骨折发生的部位密切相关。骨折的局部常有出血、肿胀、疼痛和功能障碍。如翅膀发生骨折时，患翅下垂，不能飞行；腿部骨折时，病鸟常单脚站立，患肢悬吊而不能行走，或独脚跳跃；趾掌骨骨折时，病鸟站立不稳，患肢不敢着地，肢行。完全性、开放性骨折者，症状更为严重。 ^24 N'`` m~*qS4

本病的症状有特征性，因而不难作出诊断。局部触诊有助于进一步确诊和判断骨折的类型和性质。#\C(4E'#.B-b51Uz

一旦发生骨折，即将病鸟捉出，检查什么部位骨折，使其复位。在助手的协助下，首先对断骨进行整复。如开放性骨折，应先用双氧水或雷佛奴耳药液清洗并整复断骨后缝合皮肤，再用碘酊作局部消毒。随后用剪成0．5～0．6厘米宽的长条消炎止痛胶布缠绕包扎患部，每圈间相互重叠约1／2（0．25～0．3厘米）。体型较大者，应加用二片薄木片、竹片或厚纸板做成的小夹板，左右或前后夹住骨折的两端，将患部加以固定和包扎。处理后，将病鸟放回笼内单独饲养，去掉栖杠，置于僻静处休养，尽量不要惊动它，平时可用笼罩罩上，减少活动。接骨后的饲养很重要，要供以营养丰富而且易消化的日料，适当补给维生素D和钙，加强护理，保持环境的安静。加水添料时动作要轻，笼子的粪便先不要清理。为预防继发性细菌感染，可酌情使用一些抗生素。在非感染性伤口的情况下，通常10～14天即能除去夹板，预后良好。<C~$-z7cK x?V^ l*

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鸟肥胖症的防治:S9GhE K<:%ofB"S

肥胖症是由于观赏鸟长期在笼内生活和过多地采食油脂性饲料、缺乏运动，或脂肪代谢紊乱，致使鸟体内特别是皮下和腹腔内积存过多的脂肪而发生的，属于营养代谢疾病，多发生于老龄鸟。 kEv;2<uv `)Q9

患有肥胖症的鸟胸腹部位明显肥大，体重明显超过正常水平。用手扒开或用嘴吹起鸟的腹部羽毛，可见腹部饱满变圆而呈球形，甚至可见皮下黄色的脂肪，如果看鸟的尾脂腺，则明显变大，有黄白色的脂肪块。另外，还可用手摸鸟的胸骨部位，如发现扁平也是肥胖症的表现。鸟体过于肥胖则动作迟缓，不爱活动，鸣叫时间不长，甚至停止鸣叫。平时善斗的鸟动作变得迟缓，失去了战斗力。心跳减缓，呼吸次数增加。肠胃机能减弱，常有便秘，机体抗病力下降，易受外界得细菌和病毒感染而生病，甚至会在跳跃、飞行或惊吓中死亡。剖检死鸟，体内脂肪明显增多，肝脏、心脏和肾脏贮积大量脂肪。 v]b|@ PT ]|eMEN['

为了避免鸟得肥胖症，平时注意及时调整饲料的比例，控制食量，尽量选用较大的笼舍，让鸟多活动。冬季和春季注意不要将鸟放在过于温暖的地方,只要略高于最低的耐受温度就可以了。对过于肥胖的鸟可在饲料中减少含脂肪高的饲料，特别少喂含脂肪高的动物性食物，多喂水果和蔬菜等青绿饲料和蛋白质饲料，不能断水。与此同时，应控制鸟的饲料量，多外出遛鸟，以增加运动量。为了增加鸟的活动量，也可以在晚上将鸟置于灯光下，人为地延长它的活动时间。待肥胖症消除后，再投喂正常的饲料量。 vnP,;K s`H|o'0

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防治鸟的趾脱落~^xE0YA){&! h~UZ

1.起因与症状 IBC&w|)l|(*btdqy3

不注意鸟笼清洁，使鸟趾之间经常沾污鸟粪，或鸟趾经常受冻，都能引起趾关节发炎或坏死， e]9!i J.:

使趾骨逐级脱落，无法握住栖架，行走困难这种病以软食鸟发生较多，地栖性的软食鸟更多，如;ccP_"2z/klo),|&

红点颏、蓝点颏、白喉叽鸫、地鸫等，稍不注意就会得这种病。 j~Ao:f_5oS eA
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2.防治方法 faM eF# 1}|y^oB\-

注意鸟笼清洁，经常供给水浴；冬天因水浴减少，可给鸟清洗脚趾。冬天鸟笼应置于稍温暖!="46q6H6)e P Qxx

处，以防脚趾冻伤。已发生了趾关节脱落，就无法再生复原。 ] dptX/"O4f9n

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鸟中暑的防治措施 nSW'Xqiz@q<h.#9

在夏季如果对观赏鸟的管理不当，就有可能使其中暑。鸟的羽毛有良好的绝热性，使热量不易散发，再加上鸟没有汗腺，也会影响体热的散失。鸟散热的唯一途径是张口呼吸。在炎热的夏天，如果放置鸟的室内温度过高、通风条件差、闷热，加上饮水供给不及时，使鸟散热困难，常引起中枢神经系统和呼吸系统的功能障碍。除上述发生中暑的原因外，鸟在封闭、拥挤的条件下运输，也容易发生中暑。,W|/)WA$W\R@}X cqZ

鸟中暑后表现为烦躁不安，呼吸急促，体温升高，张口喘气，呼吸频率明显加快。继而表现为精神委顿，翅膀张开下垂于地面，站立不稳，虚脱，大量饮水。有时出现短暂抽搐，足趾麻痹，躯体和颈部肌肉痉挛，常在几分钟内死亡。剖检可见大脑及脑膜充血、出血和水肿。死前体温比正常升高3℃以上。尸检可见尸僵缓慢，全身淤血。 H3%YpU,{ eyDI>7W

为了避免观赏鸟出现中暑现象，在夏季应把鸟笼放在凉爽、通风、安静、宽敞的地方，避免阳光直射。遇闷热天气时，应经常观察鸟的表现，并供给充足的饮水，每天更换清凉的饮水1～2次，每天给鸟水浴1次。对已发生中暑的观赏鸟，应立即将鸟笼移至树荫下等阴凉的地方，每隔一段时间喷洒1次冷水，同时给予清凉饮水，通常可以很快恢复。也可以在绿豆汤中加1～2滴十滴水喂服，或用藿香正气水0.5毫升加冷开水0.5毫升喂服。中暑严重的观赏鸟，可以在翅膀的静脉血管处，用消毒三棱针或普通缝衣针由前向后沿静脉血管平刺0．1～0．3厘米，流出污血即可。观赏鸟中暑后要加强护理，因病鸟在1—2天内对各种疾病尤其是呼吸道传染病的抵抗力会降低，要防止鸟患感冒、肺炎等疾病。%;;N#{xU( rjc
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鸟肠炎怎样防治？=tSNB3?X i=b'_SZ'

肠炎是伴有肠的分泌、蠕动、吸收或排泄机能紊乱的炎症的总称，肠炎是家庭观赏鸟易患的消化道疾病。引起肠炎的原因是多方面的，包括饲料因素，季节变化，气候突变，受寒，细菌、病毒感染等。但引起肠炎的主要原因是笼舍、水罐、食具等不卫生，甚至吃了不洁、腐烂或发霉变质的饲料和饮用脏水所致。患病的季节性比较明显，尤其在夏季天气热，多雨潮湿，饲料易变质，饮水不清洁等都可能会引起肠炎。 89.`:r_h{D B&Z0ZWx

病鸟初期精神正常，也有食欲，但粪便呈水样，粪便中有未消化的食物，排泄次数明显增多。病情加重时表现精神委靡，食欲减退，身躯无力，不断饮水，体温升高，常趴杠或卧在笼底不动。全身缩起，羽毛松乱，粪便呈水样，不良信息常被稀粪污染，严重时粪便呈粘液性或血性下痢。剖检死鸟，可见不同程度的肠炎。 3TQm_]\v aMydeTCHi

为了防止观赏鸟患肠炎，需要注意食具、水罐的卫生，不喂变质的饲料，夏季可在饲料中拌些抗菌素和食母生等助消化的药物，或在饮水中加土霉素，配成0．1％浓度，自由饮用。复方敌菌净常用于消化道的细菌感染，因用量较小，在消化道吸收率较低，故安全性好于其他磺胺类药物。混料喂，治疗量为0．03％，每天1-2次，连喂3-5天。对患病初期的鸟可用饥饿疗法，停止供食4-5小时后再放饲料。在停食期间仅供给清洁的饮水，以清理肠胃。饮水中可放入一些浓度为0.1%的高锰酸钾，使水呈葡萄色即可。也可将四环素与食母生溶于水中喂服，每天2次。然后给以易消化的食物，并在饮水中加0．2％的黄连素，连喂3-5天。病情严重时可喂痢特灵，混料浓度为0．03％-0．04％，混水浓度为0．02％，每天1-2次，连喂5天。如粪便伴有出血者可加喂仙鹤草片。对因腹泻而脱水的鸟应补充糖水和盐水，其方法是在25％葡萄糖水中加0.9％生理盐水，用不带针头的注射器吸入上述溶液后滴入患鸟的口中，每次滴1-2毫升，每天2次，连喂5天。$3H4K+L j^ 8Hjg

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怎样认识新城疫，如何防治 8 t(L%$\#h/P3Pv"r|8]

本病是由病毒引起的急性高度接触性传染性疾病。特征为呼吸困难，下痢，神经机能紊乱，粘膜和浆膜出血。:>=]#~<cz<]S M$)=D

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病原：该病由副粘液病毒属的病毒引起”此病毒对消毒药、日光及高温的抵抗力不强.2％烧碱、1％-2％甲醛、1％-2％来苏尔等消毒剂均可于几分钟至20分钟内将其杀死。在夏季直晒阳光下约半小时死亡，加热至70摄氏度经2分钟死亡。在舍内，30-32摄氏度能存活3周至1个月。 b|xEQf?=iy 6q

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流行病学：家禽易感此病，野生鸟和现赏鸟也易感染此病。本的主要传染源是病鸟，经消化道和呼吸道感染。被病毒污染的饲料饮水、用具、笼具都能传染。除经口传染外，带毒的飞沫、尘埃可进人呼吸道而传染。病毒也可以经过眼结膜、泄殖腔和损伤的皮肤进人鸟体内。 ]-bi}/(p(U vy5{Vm".4

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症状：自然感染的潜伏期为3-5天。根据临床表现和病程的长短，可分为最急性、急性、慢性。最急性型，突然发病，常无特征症状而迅速死亡，多见于流行初期的幼鸟。急性型，病乌食欲减退，垂头缩颈，翅膀下垂，状似昏睡；咳嗽；呼吸困难，有粘液性鼻漏，常伸头，张口呼吸，鸣叫异常，口角流出多量粘液，粪便稀薄，呈黄绿色或黄白色，有的病鸟还出现神经症状，死亡率极高。量性型，初朗症状与急性型相似，不久后逐渐减轻，但时时出现神经症状，站立不稳，头颈向一侧扭转，动作失调，反复发作，最终瘫痪,病死率低。 Db/YE%*N 9~f RYA*

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防治：严格饲料管理，保证供给全价饲料。新买入的鸟必须隔离观察2周。 XM=mp@]M _Lj
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病鸟用过的笼具等要彻底清洗、消毒、日晒。发病鸟要与其他健康鸟隔离治疗，认真处理死鸟。 1j%F\F'@DR?^ qp

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预防的最好方法是免疫接种。适量加入些抗生素、维生素A等，避免继发感染其他疾病。饲喂笼养鸟繁殖预混料和“鸟乐“4号。 Y\9!mZ m<4tH5};d

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防治鸟的滞食 v8++Z,/);z/@Q

1.起因与症状 H82ydcyt+WUz#i"

如饮水中断，粗硬料、干粉料吃得太多，使饲料在滞囊中停滞不下，而引起嗦囊膨大。@j+`+p0l2 h4M>k{

病鸟食欲便会停止，精神呆。重症或拖延得太久，可使病鸟死亡。#-fE%e+JFE\>O

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2.防治方法 ]kF/SUbwD2>

病情轻者，可用植物油滴入嗦囊中，并用手向下按摩嗦囊，使食物软化而进入下消化?@u1< tj!~7lo

道。重症需手术治疗，先在嗦囊部拔云少量羽毛，用碘酒消毒后，用锋利的保安刀片（消 b@,+3Ld( 9d,2d5Y

毒过）切开0.5厘米表皮，再切开嗦囊，取出阻滞物，消毒后用丝线依次缝合嗦囊和表皮。~z0$|*%e ATU]KL!{

手术后1～2天内，须喂以柔软易消化的饲料，并连喂三天多酶片。一般经8—10天即;|4ll6-A#>\8m+h 9

能痊愈。鸟类的皮肤愈合能力极强，俗称：“鸡皮狗骨不妥之处请点评.